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Germán Sierra Marcuño
Dolores Vázquez Illanes
Teresa Oreiro García
Alejandra Núñez Rodríguez
Araceli Vázquez López
Nuestras investigaciones están centradas en los aspectos neuroquímicos y neurofisiológicos de la actividad paroxística y las crisis epilépticas en modelos experimentales en animales crónicos. Utilizamos las técnica de microdiálisis para inducir diversos tipos de crisis epilépticas mediante microperfusión en el hipocampo de quimioconvulsivantes y otras sustancias. Las sondas de microdiálisis nos permiten recoger muestras de dializado que contienen neurotransmisores procedentes del líquido extracelular correspondientes a perìodos anteriores, simultáneos y posteriores a las crisis epilécticas, todo ello en ratas despiertas con libertad de movimientos. Una buena parte de nuestro reciente trabajo ha consistido en el estudio de aminoácidos neurotransmisores y sus receptores durante crisis epilépticas inducidas por picrotoxina y latrunculina
Microdiálisis: Una calle de doble sentido para la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas
La microdiálisis ha sido ampliamente utilizada para medir concentraciones
extracelulares de neurotransmisores, como método directo o indirecto de evaluar
los cambios producidos en la liberación de neurotransmisores. Sin embargo,
algunos de los neurotransmisores que se encuentran en el líquido extracelular
cerebral (LEC) no proceden exclusivamente de las neuronas, sino que son liberados
y recaptados por las células de la glía. Por lo tanto, la medida de
las concentraciones de neurotransmisores en el LEC no nos muestra el origen de las
sustancias analizadas, pero sí nos permite estudiar el medio interno cerebral
y las modificaciones inducidas por fármacos en él.
Para investigar los mecanismos neuroquímicos de las crisis epilépticas y buscar nuevas dianas farmacológicas para posibles fármacos antiepilépticos, hemos utilizado la técnica de microdiálisis como una "calle de doble sentido" que nos permite estudiar, en el mismo animal, aspectos relacionados con la regulación extracelular e intracelular de los receptores y mecanismos de transporte de algunos neurotransmisores.
Hemos trabajado a partir
de la hipótesis de que algunos aminoácidos extracelulares como el aspartato,
el glutamato y la glicina juegan algún papel en la modulación de la
excitabilidad neuronal, probablemente por au acción sobre los receptores NMDA
del glutamato. Para poner a prueba nuestra hipótesis, hemos realizado una
serie de investigaciones que incluyen el estudio de:
1. las concentraciones extracelulares de aminoácidos en relación con
la excitabilidad neuronal estudiada por EEG (1,2).
2. Cambios en la actividad de los receptores y en la concentración de aminoácidos
mediante la perfusión de antagonistas de receptores (3,4).
3. Recaptación neuronal y glial de neurotransmisores y su efecto en la excitabilidad
(6), así como el efecto del aumento artificial en la concentración
de aminoácidos (7).
4. Modificaciones en la regfulación intracelular de los receptores perfundiendo
inhibidores enzimáticos (5) y agentes despolimerizantes de la actina (en prensa)
Nos hemos encontrado con que la combinación de microdiálisis y técnicas de registro electrofisiológico es una herramienta muy útil para estudiar la acción extrasináptica de los aminoácidos, tanto en las neuronas como en las células gliales. También permite estudiar in vivo algunos aspectos de la regulación de los receptores que sólo habían sido investigados in vitro. Creemos que algunos fármacos muy utilizados podrían actuar sobre receptores extrasinápticos, y es muy probable que los mecanismos intracelulares de regulación de receptores nos proporcionen algunas de las próximas dianas para el desarrollo de nuevos fármacos.
Referencias:
1.G. Sierra-Paredes et al. Neurosci. Lett. 248, 53-56 (1998)
2. G. Sierra-Paredes et al.. Epilepsia, 40, suppl 7, 5 (1999)
3. G. Sierra-Paredes et al.. Neurosci. Lett. 218, 62-66 (1996)
4. G. Sierra-Paredes et al. Epilepsia, 38, suppl 7, 6 (1997)
5. G. Sierra-Paredes et al. Neurosci. Lett. 263,165-168 (1999)
6. G. Sierra-Paredes et al. Neurochem. Int. 37, 377-386 (2000)
7. G. Sierra-Paredes et al. Brain Res. 888, 19-25 (2001)
Representación de una sonda de microdiálisis insertada en el hipocampo de la rata y electrodos para registro EEG soldados a un conector (vista frontal)
vista lateral
Dibujo del sistema experimental diseñado para el estudio de las crisis epilépticas inducidas en ratas por quimioconvulsivantes. Se utiliza un sistema de microdiálisis CMA, y se monitoriza la actividad EEG mediante un sistema holter. Las crisis son grabadas en vídeo.
Sistema de Microdialisis
Raturn® de BAS también usado en nuestro
laboratorio y Holter EEG de Oxford instruments
Las muestras de microdializado son analizadas por HPLC utilizando un sistema Waters Alliance®
detector 2475 fruorescence de Waters utilizado para detectar aminoácidos en nuestro laboratorio
Estabilidad de las concentraciones extracelulares de aminoácidos durante un período de 6 meses (los experimentos se realizaron con un intervalo de 1 semana)
Crisis epilépticas indudidas por microperfusión de picrotoxina en el hipocampo de la rata (de Sierra-Paredes & Sierra-Marcuño, 1996)
Libros sobre microdiálisis
Microdialysis in the neurosciences. T.E. Robinson and J.B. Justice Jr., Elsevier, 1991
Otros métodos in vivo: Virtual lesions
Equipos de microdiálisis
