II - LE FIBROBLASTE : INTERACTIONS MATRICIELLES

Nous venons de voir que le fibroblaste est soumis à une expression phénotypique évolutive au cours des étapes du développement. En fait le fibroblaste représente une des meilleures illustrations de l’influence de l’âge sur la vie cellulaire : à l’évidence, les mécanismes de contrôle de la prolifération et de la différenciation sont très ubiquitaires, dépassent largement la période embryonnaire, et se retrouvent à toutes les étapes. Comme certains le suggèrent, le vieillissement représenterait le terme ultime du développement. Par ailleurs, vieillissement et cancer sont liés par des facteurs communs impliquant les cascades oncogéniques.

L’évolution phénotypique du fibroblaste au cours de la sénescence évoquait déjà une grande variabilité et des capacités remarquables d’adaptation. Nous allons voir que c’est aussi un bon modèle de compréhension des interactions avec l’environnement, plus particulièrement avec la matrice extracellulaire.

II-1 LE FIBROBLASTE : SYNTHESE DES MOLÉCULES MATRICIELLES

Le fibroblaste est une cellule isolée au sein du tissu conjonctif. Il a préservé en grande partie les potentialités de la cellule originelle mésenchymateuse. Il synthétise la quasi majorité des molécules matricielles. Inversement c’est l’environnement matriciel qui modulera le programme de prolifération/différenciation et le niveau d’activité des fibroblastes.
La matrice est également un intermédiaire obligé du contrôle de trophicité des épithéliums.

Il faut admettre qu’il existe un PROGRAMME de synthèse des molécules de la matrice par le fibroblaste.
Dans un premier temps, la programmation est essentiellement génétique, liée à “l’horloge” du développement foetal. Ultérieurement, les conditions environnementales (conditions nutritionnelles, contraintes mécaniques, radiations solaires, facteurs de croissance locaux, etc.) viennent modifier la programmation génétique originelle et l’expression phénotypique du fibroblaste.
Dans tous les cas, ce sont les produits de sécrétion du fibroblaste qui constituent l’outil d’adaptation du système. Nous aborderons 2 thèmes dans la suite de l’exposé :
- l’étude des grandes classes de molécules matricielles et leur mode de biosynthèse
- l’étude de quelques interactions cellules/matrice, et de leurs conséquences

II-1-1 FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES PROTEINES MATRICIELLES : LES 4 GRANDES CLASSES

Comme nous l’avons déjà vu dans un chapître précédent, les fibroblastes sécrètent 4 grandes classes de molécules matricielles.

LES COLLAGENES : plus de 20 types sont connus, à classer entre fibrillaires et non fibrillaires, mais tous ayant un variant d’un précurseur commun : la chaîne a du procollagène. 3 chaînes a forment une structure en triple hélice caractéristique.

LES ELASTINES : constituées de différentes classes de microfibrilles associées à l’élastine, résultant de la maturation d’un précurseur, la tropoélastine dont il existe plusieurs variants par épissage alternatif. La tropoélastine en maturant subit des pontages la rendant insoluble par des mécanismes enzymatiques faisant apparaitre des acides aminés tetravalents (desmosine) à partir de radicaux lysyl.

LES GYCOSAMINOGLYCANES ET LES PEPTIDOGLYCANES. Le plus simple étant le hyaluronane, les autres pouvant être regroupés en chondroïtine sulfate, kératane sulfate, héparane sulfate, héparine et dermatane sulfate. Une nouvelle nomenclature tend, comme pour les lipoprotéines, à reconnaitre ces molécules par la protéine porteuse plus que par la nature des chaînes GLYCANE.

LES GLYCOPROTEINES DE LIAISON (NECTINES). Fibronectines et laminines constituent les chefs de file. Elles assurent la liaison entre les fibres de la trame matricielle et les cellules.


A ces 4 groupes,
IL CONVIENT D’AJOUTER LES RECEPTEURS MEMBRANAIRES SPECIFIQUES : Il s’agit essentiellement de la grande famille des intégrines qui permettent d’adaptater le programme de prolifération/différenciation, aussi bien que les réponses immédiates des cellules : transferts, motilité, synthèse/sécrétion, etc.

II-1-2 LE FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES PROTEINES MATRICIELLES : LES COLLAGENES


DES PROTÉINES UBIQUITAIRES :

Les collagènes sont présents dans la matrice extracellulaire de tous les animaux pluricellulaires. Dénaturés par la chaleur ils génèrent des colles (d'où le nom de collagène) ; la forme la plus classique de collagène dénaturé étant la gélatine.


DES PROTÉINES MULTIFONCTIONNELLES

1 - Les collagènes ont un rôle mécanique :

- Cette propriété est bien illustrée par la solidité du cuir qui n'est pas autre chose que du collagène rendu imputrescible par tannage.

- Les collagènes forment des enveloppes protectrices et des charpentes aux organes mous (foie, rate, ganglions lymphatiques ... ) : la trame grillagée de réticuline en est l’exemple le plus typique

- Par minéralisation ils constituent les tissus durs : les os et l'ivoire des dents.

- Par association à des protéoglycanes, ils vont former

- des tissus lubrifiants (cartilages) au niveau des articulations

- des systèmes amortisseurs (disques intervertébraux)

- des tissus transparents (cornée).

- Par compaction ils forment tendons et ligaments et transmettent des forces.


2 - Les collagènes interviennent dans la différenciation :

- Ils jouent un rôle important dans la morphogenèse (en particulier le collagène IV).
- En culture cellulaire, certaines différenciations exigent la présence de collagène.


UNE MEME FAMILLE BIOCHIMIQUE :

Toutes les collagènes sont composés de trois chaînes polypeptidiques :

Les chaines alpha possèdent 2 types de domaines :

- des domaines collagéniques avec un motif répétitif de trois acides aminés:

avec X et Y = Pro ou Hypro le plus souvent.



Les chaînes alpha forment des alpha-hélicea gauches
3 chaînes alpha s'associent pour former le procollagène (enroulement en super-hélice droite)
Selon les cas, une même molécule de procollagène peut être constituée d'une, de deux ou de trois sortes de chaînes alpha.

- des domaines non-collagènes ou non-hélicoïdaux sans répétition particulière

NB : D’autres protéines répondent à ce type de structure, mais elles n’appartiennent pas à la matrice extracellulaire.

UNE MEME FAMILLE MAIS UN GRAND POLYMORPHISME :

La séquence primaire, le pourcentage et la répartition des domaines collagéniques et non collagèniques permettent de classer les collagènes en 2 grandes familles aux propriétés différentes :

- Les collagènes fibrillaires (type I, II, III, V et XI) :

3 chaînes alpha uniquement constituées de domaines collagéniques s’assemblent dans le fibroblaste sous forme d’une triple super hélice de 300 nm de long. Les extrémités sont flanquées d'extensions N et C-terminales majoritairement non-collagéniques. L’ensemble constitue le procollagène.
Une maturation extracellulaire élimine ensuite les domaines non collagéniques et forme la molécule de tropocollagène. Les tropocollagènes s’enchaînent ensuite bout à bout et forment les fibrilles de collagène
L'agencement régulier et parallèle des motifs de 300 nm de tropocollagène, avec un décalage d'un quart de la molécule, conduit à la formation des fibres de collagène. Ce décalage se traduit par l'observation en microscopie électronique, d'une striation périodique de 67 nm.

- Les collagènes non-fibrillaires
Ils ont la particularité d’être aussi constitués par des triples hélices de chaînes a mais les domaines de type collagénique (COL) sont interrompus par des domaines non collagéniques (NC). Ces collagènes restent “articulés” et ne peuvent former des fibrilles semi-rigides. Ils se retrouvent souvent en surface des collagènes fibrillaires. Parmi ceux-ci on trouve les types IX, XII, XIV, XVI (FACIT : Fibril associated collagens with interrupted triple helice).
Ils servent de liens divers (cross linking) entre les fibres, la matrice et les cellules.

- Enfin le collagène de type IV mérite une place à part
Il forme le réseau primaire des membranes basales (voir le paragraphe spécifique).


BIOSYNTHESE DES COLLAGENES FIBRILLAIRES

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BIOSYNTHESE DES COLLAGENES NON FIBRILLAIRES

Ces types de collagènes sont très variables dans leur architecture spatiale : leur molécule est articulée. Ils modulent l’assemblage des autres collagènes. En ce sens ils participent très largement à la diversité des tissus conjonctifs en fonction des localisations et de l’expression phénotypique des différents fibroblastes. Ils sont généralement situés à la surface des collagènes fibrillaires où ils associent des faisceaux de collagène entre eux (voir figure ci-dessous). Mais leur extension aminoterminale peut interagir avec d'autres molécules de la matrice ainsi qu'avec des cellules. Le type VII forme les fibres d'ancrage sous-épithéliales. Le type XVII forme même des ancrages sur des cellules épidermiques au travers de la lame basale.

Les particularités de biosynthèse les plus importantes sont représentées ci-dessous.

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BIOSYNTHESE DES COLLAGENES NON FIBRILLAIRES

Ces types de collagènes sont très variables dans leur architecture spatiale : leur molécule est articulée. Ils modulent l’assemblage des autres collagènes. En ce sens ils participent très largement à la diversité des tissus conjonctifs en fonction des localisations et de l’expression phénotypique des différents fibroblastes. Ils sont généralement situés à la surface des collagènes fibrillaires où ils associent des faisceaux de collagène entre eux (voir figure ci-dessous). Mais leur extension aminoterminale peut interagir avec d'autres molécules de la matrice ainsi qu'avec des cellules. Le type VII forme les fibres d'ancrage sous-épithéliales. Le type XVII forme même des ancrages sur des cellules épidermiques au travers de la lame basale.

Les particularités de biosynthèse les plus importantes sont représentées ci-dessous.

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BIOSYNTHESE DES COLLAGENES

Le schéma ci-dessous résume les capacités fonctionnelles des fibroblastes pour synthétiser des collagènes régionalement adaptés, ainsi que le contrôle par l’interaction cellule-matrice.

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COOPERATIVITE CELLULES-MATRICE : EFFETS RECIPROQUES, ET PLASTICITE DU TISSU CONJONCTIF

CARACTERISATION DES FIBRES ELASTIQUES :

Les fibres élastiques se retrouvent en abondance dans les artères élastiques et musculaires, dans les poumons, le coeur et la peau. Contrairement aux collagènes, ce constituant n'existe que chez les vertébrés

 Observées au microscope électronique, on remarque que les fibres élastiques résultent de l'association de deux composants morphologiquement différents :

q Au centre, on trouve un matériel amorphe majoritaire (90%. des fibres matures) transparent aux électrons ou finement granuleux. Il n’y a pas de striation apparente, contrairement aux fibres de collagène. Ce matériel correspond à l'élastine.

q A la périphérie mais aussi à l'intérieur du matériel amorphe, on trouve des microfibrilles de 10 à 12 nm de diamètre, de nature glycoprotéique : les fibrillines.

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BIOSYNTHESE PAR LE FIBROBLASTE :

L'assemblage de ces différents constituants s'effectue à l'extérieur du fibroblaste, mais à proximité immédiate de la membrane plasmique, souvent dans une véritable gouttière ménagée par celle-ci.
La biosynthèse de ces différents éléments est complexe et fortement controlée par le fibroblaste :

- l'adressage sécrétoire vers le site d'assemblage est contrôlé par des proteines chaperon

- il existe plusieurs gènes distincts des fibrillines (poids moléculaires variables)

- l'élastine et synthétisée sous forme de tropoélastine, une proteine soluble de 70kD riche en glycine (33%) et en proline (10%), formant des feuillets ß, et soumise à un épissage alternatif, variable selon les stades du développement.

- La tropoélastine, primitivement soluble, est rendue insoluble au cours de l'assemblage des fibres élastiques par des réactions d'oxydation effectuant des pontages sur les radicaux lysyl grace à une enzyme exprimée par le fibroblaste : la lysyl-oxydase. Cette enzyme catalyse un processus de désamination oxydative qui par aldolisation fait apparaitre des acides aminés particuliers (desmosine et isodesmosine) et des pontages. des molécules d’élastine adjacentes (A et B sur le schéma).

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II-1-3 FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES PROTEINES MATRICIELLES : LES FIBRES ELASTIQUES

ORGANISATION DES FIBRES : INTERACTIONS LATERALES

L’aldolisation permet d’obtenir une cohésion latérale des structures moléculaires entre-elles et ainsi de compacter les fibres élastiques.
Mais ce processus est beaucoup plus ubiquitaire : il concerne toutes les fibres du tissu conjonctif. L’exemple ci contre correspond à du collagène fibreux).
Toutes les fibres conjonctives subissent des phénomènes de cross-linking qui augmentent la compacité des structures :

- soit par aldolisation des résidus lysines,
- soit par interactions hydrophobes (importantes pour les fibres élastiques)
- soit par interaction avec les collagènes non fibrillaires ou d’autres molécules matricielles,
- soit encore par des polyglycosylation, également sur les résidus lysyl.

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PROPRIETES FONCTIONNELLES DES FIBRES ELASTIQUES :

De façon générale les fibres élastiques confèrent la propriété d'élasticité aux organes qui les contiennent. Si on devait caricaturer on pourrait dire que :

- les fibres de collagène résistent à l’étirement et aux tractions.
- les fibres élastiques ramènent en configuration de base après un étirement mécanique.

Le schéma ci-desous illustre les différences de configuration stérique qui peuvent être imaginées au sein des fibres élastiques.
Au repos les fibres sont moins structurées ; les molécules constitutives sont davantage disposées au hasard ; les acides aminés, très hydrophobes, sont enfouis et non exposés au milieu aqueux environnant. Aprés étirement l’interface avec l’eau augmente consi-
dérablement et provoque une forte diminution d’entropie du système. Le retour à la longueur originale est spontané, car accompagné d’une forte augmentation d’entropie.

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CONSEQUENCES PHYSIOLOGIQUES ET PATHOLOGIQUES (1) :

Le rôle mécanique des fibres élastiques est bien illustré au niveau vasculaire.

Dans la paroi artérielle leur fonction est particulièrement essentielle : elles permettent le retour au calibre initial après la contraction systolique et l'éjection du sang par les ventricules. Pour assurer cette fonction, les fibres élastiques de l'aorte et des grosses artères sont organisées en lames concentriques, parallèles à la surface du vaisseau (sera décrit dans un cours spécifique). Il est intéressant de noter que, parfaitement adaptées aux fonctions qu'elles assurent, les fibres élastiques voient leur densité diminuer le long de l'axe aortique et des grosses artères, lorsqu'on va du coeur vers la périphérie.

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Les fibres élastiques sont impliquées dans de nombreuses pathologies

Certaines sont purement génétiques : La maladie de Marfan fut une des premières connues. L’atteinte de la fibrilline entraine une fragilité très grave des vaisseaux de grand calibre, de l’aorte particulièrement.
D’autres résultent d’atteintes progressives dues souvent à des pathologies générales ou à l’avance en âge.
Le vieillissement de la peau, largement aggravé par l’exposition solaire, est paradoxal pour l’aspect des fibres élastiques : les fibres augmentent significativement en nombre dans le derme, et pourtant la peau âgée perd de son élasticité. C’est en fait l’orientation des fibres élastiques qui est altérée (perte du réseau perpandiculaire au plan cutané).

Mais ce sont les atteintes vasculaires qui sont beaucoup plus graves. Au cours du processus athéroscléreux, mais également avec l'avance en âge, ou encore dans les pathologies diabétiques (les trois situations peuvent être rencontrées simultanément), les fibres élastiques ont tendance à dégénèrer. Des lipides (esters de cholestérol) et des acides gras libres se déposent au sein des fibres élastiques et attirent les ions calcium. Le dépôt d'ions calcium potentialise celui des lipides et vice-versa. L'élastine perd ainsi de son élasticité. Par ce mécanisme, les fibres commencent à se dégrader chimiquement. Ultérieurement une dégradation enzymatique sera provoquée par une surexpression des élastases qui aggrave la dégénerescence.


La proportion en fibres élastiques est soumise à un contrôle strict

Les fibres élastiques n’apparaissent qu’à partir de la deuxième moitié de la gestation.

L’expression des protéines constitutives (fibrillines et tropoélastine) est sous la dépendance de la secrétion de nombreux facteurs de croissance tels que le TGFß ou plus encore l’IGF1, mais également sous la dépendance des glucocorticoïdes ainsi que de l’acide rétinoïque.

Spontanément les fibres élastiques sont très difficilement dégradables. Il s’agit, avec le collagène et les kératines, d’une des variétés de protéines les plus indestructibles : la durée moyenne de vie d’une molécule d’élastine atteint 70 ans.

Néanmoins l’organisme exprime des élastases, enzymes spécifiques de l’hydrolyse des fibres élastiques (coupures de liens pro-gly, ala-gly ou tri-ala)
Même s’elle est très lente la dégradation partielle physiologique des fibres élastiques est possible dans le temps. En outre la dégradation enzymatique des fibres élastiques sera accélérée avec le vieillissement, puisque l’activité élastase augmente avec l’âge (voir page suivante).

Enfin, la dégradation partielle de l’élastine produit des peptides de l’élastine. Cette hydrolyse ne doit pas être considérée comme un simple phénomène de dégradation. En effet :

- Le niveau transcriptionnel de l’élastase est finement contrôlé mais aussi son activité hydrolasique : des facteurs sériques comme l’a1-antitrypsine inhibent l’activité élastasique
- les peptides d’hydrolyse de l’élastase ont un rôle essentiel sur le controle des activités de prolifération/différenciation des fibroblastes (interaction cellule/matrice)

Les niveaux d’expression et d’activité de l’élastase varient :

L’activité élastase augmente avec l’âge aussi bien in vivo que sur le modèle de Hayflick.
Par ailleurs la diminution de l’expression de l’alpha1-antitrypsine ne peut que favoriser un activité élastasique plus grande. Chez le fumeur, le déficit plus important en a1-antitrypsine avec l’avance en âge, est à même d’expliquer un risque plus grand d’insuffisance pulmonaire (altération accrue du réseau élastique alvéolaire et pulmonaire)

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Les peptides de dégradation de l’élastine contrôlent plusieurs mécanismes cellulaires , via un recepteur membranaire spécifique.

Ce récepteur, par la voie classique des phosphoinositides, favorise l’entrée du calcium dans les cellules. Ce mécanisme est susceptible d’expliquer en partie le durcissement et la calcification partielle de la paroi des vaisseaux observée avec l’avance en âge : il s’agit du phénomène d’ artériosclérose (le processus athéromateux, souvent associé, est beaucoup plus complexe ).
Le récepteur à l’élastine est aussi capable de contrôler d’autres mécanismes (voir ci-dessous)

II-1-4 FIBROBLASTE : LA SYNTHESE DES GLYCOSAMINO-GLYCANES ET PROTEOGLYCANES


DES GLYCOPROTEINES TRES COMPLEXES ET VERSATILES :

Tous les protéoglycanes (PGs) sont formés par l'association covalente entre des chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) et d’une protéine porteuse (PP). Les GAGs sont généralement liés par une liaison 0-glycosidique à une sérine de la PP dans des régions riches en séquences de type :

Tous les GAGs sont constitués d’un enchaînement répétitif disaccharidique qui permet de reconnaître plusieurs types de PGs. Le nombre de motifs disaccharidiques est très variable (n = 10 à 80). Un tétrasaccharide sert souvent d’amorce sur la sérine, avant l'addition successive des unités disaccharidiques spécifiques de chaque classe de GAG.

Le type du motif disaccharidique, associé à certaines modifications de ce motif permettent de regrouper les PGs en quelques grands types (en fait il en existe au moins 24 différents !).
Le tableau suivant en fournit un aperçu. On rapproche de la famille des PGs, par ses propriétés fonctionnelles, l'ac hyaluronique* qui est strictement un GAGs de très haut poids moléculaire

(*) structure et rôle de l’acide hyaluronique : voir le cours d’embryologie moléculaire

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Les unités disaccharidiques subissent ensuite un certain nombre de modifications : désacétylation, épimérisation (par exemple acide glucuronique en acide iduronique), mais surtout des sulfatations (N-sulfatation, 0-sulfatation). Les régions hypersulfatées des GAGs sont souvent regroupées et forment des “blocs” de charge électro-négatives sur la molécule.

Comme pour bien d’autres macromolécules matricielles, les PP de la plupart des PGs possèdent différents domaines : des répétitions de type EGF, des séquences analogues à la protéine de régulation du complément, des domaines présentant des propriétés de liaison de type lectine, etc (voir des ouvrages de biochimie pour plus d’informations sur ce type de molécules).

En fait, la connaissance ds PGs est encore récente. Une classification alliant structure-fonction est loin d’être définitivivement établie !

UNE ARCHITECTURE ET DES INTERACTIONS COMPLEXES :

Au delà de la structure élémentaire des PGs, il faut remarquer :

- que le poids moléculaire des PGs est excessivement variable, puisqu’il dépend du nombre n de motifs polysaccharidiques : de 40000 pour la décorine à 3.107 pour l’aggrecan du cartilage.
- que les PGs constituent des édifices macromoléculaires encore plus complexes par assemblage avec d’autres molécules, et en particulier avec le hyaluronane .
- que certains PGs ne sont pas extracellulaires mais constituent des molécules fortement associées à la membrane plasmique (soit par inclusion dans la membrane par la proteine porteuse, comme pour le syndécan ; Soit par liaison à la membrane sur un phosphatidyl inositol) .
- qu’il existe aussi ds PGs intracellulaire, souvent retrouvés dans les vésicules sécrétoires. Ils sont très riches en sérine et glycine (les serglycines)

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DES PROPRIETES MODULATRICES MULTIPLES :

Les structures disaccharidiques contenant un fort pourcentage de groupements sulfates confèrent aux GAGs, et donc aux PGs, un certain nombre de propriétés biologiques importantes. La protéine porteuse des PGs ménage également des interactions multiples. De ce fait, les PGs ont de très nombreuses propriétés fonctionnelles :

- Ils modulent l’espace hydrique extra-cellulaire et sa viscosité. Ils forment un maillage des espaces avec des densités de charge variables créant une barrière sélective en fonction de la taille et de la charge. Le rôle du perlecan dans la membrane basale du glomérule rénal est un exemple typique (voir les paragraphes suivants sur les lames basales).

- Ils interagissent avec les facteurs de croissance. Par exemple, le FGF peut se lier à l’héparane sulfate, ce qui potentialise sur certaines cellules sa liaison au récepteur (à tyrosine kinase ; voir embryologie causale). Inversement, le TGFß est inhibé par sa liaison avec la partie protéique de la décorine
- Les PGs se lient à de nombreuses protéases ou à des inhibiteurs de protéases pour les inactiver
- Ils interagissent avec les protéines fibreuses de la matrice

- Pour les PGs membranaires, comme le syndécan, les interactions s’effectuent avec les proteines matricielles, mais également, sur l’autre versant de la membrane avec le cytosquelette. Ces types de PGs constituent de véritables récepteurs, similaires aux intégrines.

- Les PGs intracellulaires sont surtout localisés dans les grains et vésicules de sécrétion. Ils interagissent avec les autres molécules pour faciliter le stockage, le compactage et une éventuelle inactivation des enzymes contenus dans le grain (formation des grains de zymogènes, voir cours sur les épithéliums)

UN ROLE ESSENTIEL SUR LA BIOSISPONIBILITE MOLECULAIRE :

Les capacités pour le PGs d’effectuer des “cross-linking” avec les molécules et structures environnantes (et avec des niveaux d’affinité excessivement variables) créent un espace local de modulation des effets biologiques.
Ce rôle des PGs est souvent méconnu. Il est particulièrement important pour les protéines extracellulaires dont la biodisponibilité peut être largement modulée.

En effet, un PG peut modifier la biodisponibilité d’un protéine par plusieurs mécanismes potentiels :

- en limitant la diffusion de la molécule et en la piégeant in situ,

- en modifiant (positivement ou négativement) l’activité d’une protéine par contraintes sur sa configuration stérique,

- en facilitant son accumulation locale,

- en protégeant une protéine contre une dégradation protéasique,

- en facilitant ou en limitant les interactions avec un récepteur membranaire,

- etc.

UN CHAMP DE RECHERCHE ENCORE IMMENSE :

Les bases moléculaires des variations possibles des PGs sont loin d’être éclaircies et de nombreuses questions restent encore en suspens :

- Cela est vrai pour leur biosynthèse : le déterminisme de l’enchaînement séquentiel des motifs osidiques est loin d’atteindre la connnaissance que nous avons pour la traduction de la séquence primaire d’une protéine.

- Cela est vrai pour le déterminisme topographique des PGs et la sélection des assemblages macro-moléculaires.

- Cela est vrai pour l’ensemble des interactions qu’ils effectuent tant dans les mécanismes de prolifération-différenciation que dans leur capacité à moduler la biodisponibilité d’une autre molécule.

UNE CERTITUDE : Les PGs ont longtemps été ignorés car ils comblent des espaces apparemment vides dans la matrice.
Ils ont au contraire un rôle essentiel dans la fonctionnalité des tissus conjonctifs.

II-1-5 FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES MOLECULES D’ADHESION

UNE FAMILLE TRES COMPLEXE :

Par rapport à ce que nous venons de décrire, les molécules d’adhésion correspondent à des maillons complémentaires dans la complexité du système. Elles assurent des liaisons indispensables pour contrôler l'adhésion, l'agrégation, l'étalement et la motilité cellulaire dans l’environnement matriciel. Elles assurent également des liaisons avec d’autres éléments tissulaires. En bout de compte elles ont un rôle clef dans la modulation des mécanismes de prolifération-différenciation, plus globalement dans l’homéostasie tissulaire à toutes les étapes du développement.
En effet ces molécules sont remarquablement adaptées pour assurer, entre les cellules et leur environnement, dans le temps et dans l’espace, une signalisation intérieur vers exterieur (Inside to Out : IO) et inversement extérieur vers intérieur (Outside to In : OI).
Elles se comportent comme une système co-récepteur/ligands matriciels qui complémente et module les voies plus classiques de transmission des signaux (hormones, facteurs de croissance, neuromédiateurs)

DES LIGANDS NATURELS :

Globalement il s’agit de protéines de haut poids moléculaire et glycosylées,

- présentant une succession de domaines : séquences d'acides aminés stéréotypées, aux fonctions souvent autonomes.
- jouant un rôle clef de ligands naturels
- entre les macromolécules de la matrice dont elles assurent une organisation supramoléculaire,
- entre les macromolécules de la matrice et les surfaces cellulaires.

Le schéma ci-dessous est une visualisation très simplifiée :

Compte tenu de leur position de lien intermédiaire dans le schéma matriciel il n’est pas étonnant que ces molécules, particulièrement la fibronectine, aient été qualifiées de “colles biologiques”.
Des colles biologiques efficaces, mais en plus subtiles et redoutablement adaptables aux
supports qui se présentent... comme nous allons le voir.


LES FIBRONECTINES

Les fibronectines sont des glycoprotéines très ubiquitaires et sont donc synthétisées par une très large variété de types cellulaires. Elles sont formées de deux sous-unités similaires, unies par deux ponts disulfure dans leur région C-terminale. Leur structure comporte trois types de répétitions internes I, Il et III (selon leur longueur en aminoacides et leur stabilisation ou non par des ponts disulfures).

Les sous-unités possèdent de très nombreux sites de reconnaissance (voir aussi page suivante), en particulier pour les cellules et pour le collagène de la matrice.

Il existe diverses isoformes de fibronectine à partir d’un gène unique. Les différences de structure sont le résultat d'un processus complexe d'épissage alternatif du transcrit primaire pour les trois régions de types I, II et III. Une région variable est également soumise à un épissage alternatif

La combinaison de tous les schémas possibles d'épissage pourrait générer jusqu'à 20 fibronectines distinctes à partir d'un seul gène. Ces formes de fibronectine dépendent du type cellulaire et de l’espèce.
La fibronectine est une des rares protéines surexprimée avec l’avance en âge chez l’homme vieillissant avec succés (sans handicaps majeurs ou pathologie associées)

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Augmentation de la fibronectine avec l’avance en âge

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LES FIBRONECTINES : Schéma d’une des sous-unité

Les fibronectines interagissent avec un certain nombre de composants: Collagène I, collagènes de type IV, fibrine, fibrinogène, héparine, protéoglycanes, surfaces cellulaires, bactéries, et même ADN et des composants du cytosquelette, etc. Ces interactions sont spécifiques et correspondent à des domaines particuliers dont la figure ci-dessus ne présente que les plus importants. Le domaine le mieux étudié est celui qui assure l'adhésion aux surfaces cellulaires. La séquence clef est formée de trois aminoacides : R-G-D. A côté des domaines répétitifs de type I, II ou III, il existe une zone variable, structuralement très différente et qui peut aussi posséder une séquence RGD d’adhésion cellulaire. L’environnement séquentiel de cette zone RGD permet la liaison avec d’autres types de récepteurs cellulaires.



LA LAMININE

Sur bien des points, la laminine a des comportements analogues à la fibronectine. Mais elle n’est pas aussi ubiquitaire : elle ne se trouve que dans les lames basales. Elle existe sous plusieurs isoformes, et en particulier la S-laminine, la K-laminine, la nicéine (Laminine V, identifiée à l’Unité Inserm-Nice), la kalinine. Toutes ces formes proviennent de gènes différents.

La laminine et ses variants comportent trois chaines, A, B1 et B2 renfermant plusieurs motifs de type EGF, des régions globulaires et des ponts disulfures.

Les laminines, comme la fibronectine, sont formées de domaines structuraux et fonctionnels interagissant avec le collagène IV, avec des PGs comme l’héparane sulfate, avec les surfaces cellulaires, ainsi qu’avec un composant spécifique des lames basales, le nidogène.

La laminine contient plusieurs motifs oligopeptidiques qui jouent un rôle dans l'adhésion cellulaire et la migration (en particulier une séquence Y-I-G-S-RL. Il y a aussi une séquence R-G-D, mais qui n'est pas le site de liaison le plus important).

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II-1-6 MOLECULES D’ADHESION ET RECEPTEURS CELLULAIRES : LES INTEGRINES

Parmi les divers récepteurs membranaires, la famille des intégrines joue un rôle très important. Ce sont des hétérodiméres constitués de sous unités alpha et ß différentes. La connaissance des intégrines est récente (Hynes, 1987).

Chaque sous unité contient un court domaine cytoplasmique, un court domaine transmembranaire, un grand domaine extracellulaire. Les sous unités a contiennent une série de trois à quatre séquences répétitives fixant des cations divalents (Ca++ et Mg++). Les intégrines peuvent être épissées alternativement, principalement dans le domaine cytoplasmique. Ce domaine cytoplasmique est en connection physique avec le cytosquelette.
De très nombreuses intégrines possèdent une séquence de reconnaissance RGD.

Remarque : les sous unités ß4 sont particulières et possèdent des répétitions de type III comme dans la fibronectine et un domaine riche en cystéine. Elles appartiennent aux hémidesmosomes (nous en reparlerons ultérieurement avec les épithéliums).

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Beaucoup de sous unités alpha ne s'associent qu'à une sous unité ß ; inversement une même sous unité ß peut s'associer à différentes sous unités alpha.
Cette possibilité, si elle rend très complexe la famille des intégrines, multiplie les possibilités de formation de dimères.
Les cellules possédant plusieurs intégrines à leur surface vont pouvoir moduler leurs propriétés adhésives en exprimant sélectivement ces molécules : il s’agit d’un remarquable outil cellulaire d’adaptation
Le tableau ci-contre, loin d’être exhaustif, permet cependant de comprendre les capacités d’interactions matricielles que peuvent ménager les intégrines.

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Les intégrines ne sont pas de simples molécules d'adhésion : elles sont impliquées dans la transduction chimique des signaux et jouent un rôle essentiel de pont entre la matrice extra-cellulaire et les cellules,

- via le cytosquelette par son rôle dans la régulation de la forme cellulaire,
- mais aussi en activant des cascades oncogéniques et des kinases (voir le cours d’embryologie causale) par des mécanismes souvent imprécis. Des motifs structuraux situés dans les parties cytoplasmiques des sous-unités des intégrines semblent jouer un rôle dans la régulation des signaux transmembranaires bidirectionnels médiés par les intégrines.

UNE NOTION FONDAMENTALE : Il est clair que les intégrines fonctionnent en bidirectionnel (ce qui est moins évident pour les recepteurs aux hormones ou aux facteurs de croissance, et a fortiori pour la neuromédiation nerveuse au niveau des synapses). Les intégrines sont des molécules capables d'envoyer des signaux centrifuges depuis l'intérieur de la cellule et d'en transmettre depuis l'extérieur de la cellule.

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Trois exemples concrets du rôle des intégrines et des mécanismes croisés inside-out/out-inside sont présentés ci dessous :

Plaquettes sanguines et coagulation :
Sur les plaquettes au repos l’intégrine alphaIIß3 se trouve sous une conformation inactive de très faible affinité pour le fibrinogène. Lors de l'activation des plaquettes, des signaux sont produits dans le cytoplasme (inside-out signaling) et vont entraîner un changement de conformation des domaines extracellulaires qui deviennent alors des récepteurs actifs pour leurs ligands. Le ligand spécifique (par exemple le fibrinogène ou la thrombospondine) peut alors reconnaître son récepteur : de nouvelles modifications de structure vont faciliter l’exposition des sites récepteurs, puis un regroupement des récepteurs dans le plan de la membrane ce qui va être à l'origine d'une cascade de réactions biochimiques intracellulaires (outside-in signaling) qui auront pour résultat un réarrangement du cytosquelette et l'agrégation irréversible des plaquettes (formation du caillot).

Au niveau des contacts focaux : (voir description dans le cours sur les épithéliums)
L'adhésion cellulaire associé à un regroupement des intégrines sous l'influence du ligand spécifique (la laminine) augmente la phosphorylation d'une tyrosine kinase associée aux points focaux (la p125fak) au niveau de la taline. La phosphorylation de cette tyrosine kinase représente un mode de transduction de signal généralisable à de nombreuses intégrines .

Au niveau des leucocytes :
L'adhésion des monocytes à la matrice extracellulaire induit des gènes codant pour des médiateurs de l'inflammation. De même l'adhésion des neutrophiles via des intégrines stimule la sécrétion de cytokines, la motilité cellulaire et une mobilisation du calcium.

II-2 LES LAMES BASALES : UN MODELE EXEMPLAIRE DES INTERACTIONS CELLULES-MATRICE

LES LAMES BASALES : UN ITEM DE JONCTION AVEC LES AUTRES TISSUS

Nous avons abordé le tissu conjonctif, tant sous ses aspects mophologiques, que morpho-fonctionnels en faisant une large place à l’histologie moléculaire qui constitue le nouveau champ de développement de la discipline.
Les lames basales sont traîtées en dernier

- parce qu’elles constituent un très bon exemple conclusif des adaptations cellule-matrice.
- parce qu’elles représentent des items jonctionnels systématiquement retrouvés entre le tissu conjonctif proprement dit et les autres tissus : item de jonction entre le chorion et les tissus épithéliaux, item de jonction autour des cellules musculaires, item de jonction autour des vaisseaux, item de jonction autour des gaines nerveuses, etc.

L’étude des autres tissus fera alors naturellement suite.

LES LAMES BASALES : DEFINITIONS

Les lames basales (LB) :

- sont constituées de fines couches orientées de matrice extracellulaire (MEC) dont l'organisation est hautement spécialisée

- séparent des cellules d'origine embryologique différente,

- sont plus spécialisées que les autres MEC par leur organisation spatiale, par leur composition chimique et surtout par leur fonctions ; essentiellement :

- barrière fonctionnelle entre des types de tissus différents,
- échanges contrôlés dans une véritable théorie compartimentale,
- contrôle des mécanismes de prolifération et encore plus de différenciation.

LES LAMES BASALES : STRUCTURE, ULTRASTRUCTURE.

En microscopie optique les lames basales sont à la limite de la visibilité avec les techniques standards : il faut avoir recours à des techniques histochimiques permettant de caractériser spécifiquement certains constituants de la lame basale

En microscopie électronique à transmission, les LBs apparaissent sous forme de trois couches :

- la lamine densa : elle est au coeur de la structure ; c’est la couche la plus caractéristique à l’observation : les interfaces sont nettes. Elle correspond majoritairement à une trame de collagène de type IV.
- la lamina rara ou lucida : à proximité des membranes cellulaires du tissu et/ou des cellules limitées par la lame basale
- la pars réticularis : c’est une zone de densification fibrillaire émanant directement du tissu conjonctif ; elle correspond à une zone d’ancrage des fibres de réticuline.

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LES LAMES BASALES : COMPOSITION MOLECULAIRE

La composition des LBs est complexe et comporte des macromolécules spécifiques et non spécifiques, expliquant que la composition varie d'un tissu à l'autre. Schématiquement on peut distinguer 4 groupes :

1 - les composés spécifiques et ubiquitaires
- le collagène de type IV
- la Laminine
- le Nidogène (ou Entactine)
- des protéoGLYCANEs à héparane sulfate (PGs-HS), en particulier le perlécan.

2 - les composés spécifiques mais non ubiquitaires :
Certains variants du collagène de type IV, le collagène de type VII, des variants de la laminine (K-laminine, S-laminine, kalinine/ nicéine/ épiligrine, etc)

3- les composés ubiquitaires mais non spécifiques, et par exemple

- BM 40/ SPARC/ ostéonectine
- BM 90/ fibuline

4 - des composés non ubiquitaires et non strictement spécifiques qui sont “piégés” dans la trame de PGs et de GAGs, et dont la biodisponibilité sera par ce fait localement modifiée .
ll s’agit d’une modulation in situ des effets paracrines (voir le cours d’embryologie pour la notion de paracrinie). Parmi ces molécules citons les facteurs de croissance, mais c’est aussi de nombreuses hormones, les cytokines (modulateurs du système immunitaire), les immunoglobulines (“anticorps”), de nombreux agents pharmacologiques et/ou toxiques, etc

Nous avons déjà décrit la plupart des structures majoritaires composant les LBs. Seuls le collagène de type IV, le nidogène, le perlécan méritent un développement complémentaire :

- LE COLLAGÈNE DE TYPE IV : (voir schéma page suivante)
C’est une macromolécule d'environ 400 nm, constituée comme les autres collagènes de trois chaînes a enroulées en supra-hélice pour former un procollagène. Bien que les domaines collagéniques soient majoritaires, la présence de domaines étagés non collagénique dans les chaînes a empêche le procollagène de s’organiser en fibrilles. L’organisation s’effectue en réseau à partir d’une première association constituant des tétramères.
Remarque : le collagène de type VII, egalement très répandu dans les LBs s’organise en structures anti parallèles formant des feuillets denses et très lamellaires.

- LE NIDOGÈNE/ ENTACTINE :
Il est formé d'une seule chaîne, d'environ 150 kDa, comprenant trois domaines globulaires (G1, G2, G3), des sites de structure analogues à l'EGF et des régions où la tyrosine est sulfatée . Après ombrage rotatoire d'un complexe de laminine et de nidogène, on a observé que le nidogène se lie sur le bras court B2 de la laminine par son extrémité globulaire C terminale du domaine G3 et au collagène de type IV par un site médian de la molécule.

- LE PERLÉCAN (héparane sulfate)
Il est constitué d'une protéine (550 kDa) qui présente des homologies structurales avec la chaîne A de la laminine et sur laquelle sont branchées trois chaînes glycanniques.

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Il ne s'agit que d'un schéma. Pour des raisons didactiques, les échelles relatives ne sont pas respectées

LES LAMES BASALES : PROPRIETES FONCTIONNELLES

Elles remplissent de nombreuses fonctions :

A - des fonctions purement mécaniques

Elles maintiennent l'architecture cellulaire et tissulaire. Il est difficile d’imaginer l’absence de lame basale, surtout pour des tissus mous. La lame basale est l’intermédiaire obligé entre les ancrages membranaire reliés au cytosquelette et les structures fibrillaires conjonctives. La lame basale permet une meilleure répartition des forces de traction tout en protégeant la membrane plasmique (qui n’ a que 7.5 à I0 nm d’épaiseur)

B - des rôles cytophysiologiques

1 - Propriétés de perméabilité des lames basales

Elles régulent les échanges d'ions et des petites molécules entre les différents compartiments tissulaires.
Le modèle le plus étudié est celui de la lame basale glomérulaire qui contrôle l'ultrafiltration du plasma au niveau rénal

La filtration est conditionnée par la taille et la forme des protéines plasmatiques, leur charge électrique nette au pH sanguin et les conditions hémodynamiques au sein des glomérules.

Le réseau constitué par les molécules de collagène de type IV représenterait le principal obstacle au passage des protéines de poids moléculaire élevé.

Par ailleurs les sites anioniques portés par les PGS-HS (perlécan) pourraient s'opposer au transfert des protéines plasmatiques puisque la plupart d'entre elles sont chargées négativement au pH sanguin, tout en pouvant partiellement modifier l’accés au maillage du collagène IV.

En bref, le reseau de collagène IV assure le niveau d’exclusion moléculaire, les autres molécules rendent possible une filtration différentielle

2 - Rôles des lames basales dans la migration, la prolifération et la différenciation cellulaires

Elles modulent les signaux qui contrôlent l'adhésion, la migration, la prolifération et la différenciation des cellules par l'intermédiaire de récepteurs membranaires

Elles sont également capables d'accumuler différents facteurs de croissance (notamment le TGFß) en modulant leur action paracrine.

Il n’est pas question de reprendre de nombreux chapitres du cours d’embryologie moléculaire ou de ce cours. Les preuves du rôle des lames basales sur la cascade oncogénique sont très nombreuses. En fait, il faut considérer que les lames basales font partie intégrante de la cascade oncogénique. Nous aurons l’occasion d’y revenir bien souvent dans les cours. Il faut surtout signaler que le mécanisme de transduction des signaux passe par le regroupement des intégrines sur la membrane (“clustering”) qui déclenche la cascade de phosphorylation, le réarrangement du cytosquelette et un changement de l’expression génique (voir page suivante)

LES LAMES BASALES : TRANSDUCTION DU SIGNAL

Les différents éléments sont initialement dispersés. Le regroupement des intégrines (cluster) s’effectue via les laminines de la lame basale (LB) (le regroupement peut etre initié par d’autres facteurs : fibronectine, anticorps, etc) et active une tyrosine-kinase (K) sur le versant interne des intégrines. L’activation des tyrosine-kinases provoquera d’autres phosphorylations, par exemple celle de la p125fak.

Une cascade de transduction fera suite et modifiera l’organisation du cytosquelette ainsi que l’expression génique.
Dès lors on comprend mieux le rôle des molécules matricielles et des lames basales sur les mécanismes de différenciation.

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MODIFICATIONS STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES EN FONCTION DE L’AGE (ET DU DIABETE)

Dans tous les tissus et tout particulièrement dans le rein, les lames basales s'épaississent avec l’avance en âge. Des modifications structurales très semblables apparaissent au cours de la plupart des diabètes, de telle sorte que le diabète est considéré parfois comme un vieillissement prématuré. Cet épaississement des lames basales provoque des insuffisances fonctionnelles progressives : au très grand âge on retrouve toujours un certain degré d’insuffisance rénale.

Les changements qualitatifs et quantitatifs des lames basales avec le vieillissement sont complexes mais une réaction importante doit être décrite car responsable de l’essentiel des atteintes observées : il s’agit de la glycation, ou réaction de Maillard. La réaction de Maillard a d’abord interessé l’industrie alimentaire : elle correspond au brunissement des denrées alimentaires au cours du temps. Cette réaction qui s’effectue spontanément, car elle ne nécessite pas d’énergie, explique une grande part du vieillissement extra-cellulaire (au même titre que nous avions abordé par les modifications oncogéniques le vieillissement intracellulaire au travers de la théorie de Hayflick).

La réaction de Glycation est présentée sur la page suivante. Elle se produit entre des sucres réducteurs, comme le glucose, et des fonctions amines (souvent la lysine). Elle aboutit d’abord à la formation d’une base de schiff (encore réversible) puis à un produit d’Amadori qui conduit irréversiblement à des composés polycycliques reliant plusieurs chaînes peptidiques .
Le collagène est particulièrement sensible à ces pontages. Ce processus aboutit à la fibrose de la plupart des tissus. Deux exemples sont particulièrement frappants :

- la cataracte : c’est une glycation qui en pontant les fibres du cristallin le rende opaque.
- l’artériosclérose : le pontage des fibres de collagène durcit la paroi des vaisseaux, en association avec le dépot de sels de calcium (voir le rôle des petits peptides de l’élastine).

MODIFICATIONS EN FONCTION DE L’AGE : LA GLYCATION

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II-3 LES INTERACTIONS ENTRE CELLULES ET MATRICE : schéma récapitulatif

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